信使核糖核酸（Messenger RNA，mRNA）技術(shù)開辟了疫苗學(xué)的新紀(jì)元。這篇綜述簡(jiǎn)要介紹了mRNA疫苗的發(fā)展，以及mRNA與納米遞送系統(tǒng)產(chǎn)生的先天免疫反應(yīng)。

The rise of mRNA vaccines

mRNA疫苗領(lǐng)域在新冠疫情中得到了快速發(fā)展，輝瑞/BioNTech 和Moderna分別研制的兩款mRNA新guan疫苗更首先獲得美國(guó)FDA的緊急使用授權(quán)1，使得mRNA疫苗受到大眾的廣泛關(guān)注。事實(shí)上，mRNA技術(shù)建立在多年的研究基礎(chǔ)之上，其概念驗(yàn)證研究最早可以追溯到三十多年前，當(dāng)時(shí)Wolff et al.注意到將裸mRNA注射到小鼠骨骼肌能夠在小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)外源性蛋白的表達(dá)2。之后在1990年代的研究mRNA也被證明可以在體外和體內(nèi)引發(fā)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)3。不過，礙于mRNA本身結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在體內(nèi)應(yīng)用后很容易降解，以及會(huì)誘發(fā)不必要的先天免疫反應(yīng)3，mRNA技術(shù)有很長(zhǎng)一段時(shí)間被認(rèn)為其臨床應(yīng)用性較低。隨著近十多年科學(xué)的進(jìn)步，這些mRNA疫苗的研發(fā)難點(diǎn)逐漸被克服，例如通過進(jìn)行化學(xué)修飾使mRNA增加穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)免疫原性、使用納米粒子技術(shù)提高mRNA的胞內(nèi)表達(dá)和遞送效率等。其中，脂質(zhì)納米顆粒（LNP）是當(dāng)前最主流的mRNA疫苗的納米遞送系統(tǒng)。LNP-mRNA技術(shù)平臺(tái)現(xiàn)時(shí)已被廣泛應(yīng)用在各種疾病（如癌癥、傳染病或遺傳疾?。┑念A(yù)防性疫苗或治療性疫苗的臨床前或臨床研究4。

Overcoming the innate immune responses

mRNA是由DNA作為模版轉(zhuǎn)錄而來(lái)、帶有蛋白質(zhì)合成編碼信息的一類單鏈RNA（ssRNA）。合成mRNA可以通過體外轉(zhuǎn)錄酶促反應(yīng)（in vitro transcription enzymatic reaction，IVT）產(chǎn)生3。不過，由于RNA具有天然的免疫刺激特性，在進(jìn)入細(xì)胞時(shí)，外源的體外轉(zhuǎn)錄mRNA會(huì)被機(jī)體免疫防御系統(tǒng)的第一道防線識(shí)別，激活不同的模式識(shí)別受體（PRRs），例如位于內(nèi)體的TLR7/85。而IVT制備過程除了產(chǎn)生目的產(chǎn)物mRNA本身外，還會(huì)產(chǎn)生各種副產(chǎn)物。其中主要的副產(chǎn)物雙鏈RNA（dsRNA）可以被TLR3和細(xì)胞質(zhì)中的RIG-I/MDA-5特異性識(shí)別5。PRRs對(duì)RNA的感知會(huì)觸發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)生IFN-α和IFN-β等I型干擾素和促炎性細(xì)胞因子（見圖1）5。這些先天免疫激活可以有不良的影響，它們可以抑制mRNA的翻譯和蛋白抗原合成，甚至引發(fā)細(xì)胞死亡，最終降低mRNA疫苗的有效性。

為了克服這種先天免疫應(yīng)答，Kariko? et al.首先嘗試化學(xué)修飾IVT mRNA，他們通過使用天然存在的假尿苷（Pseudouridine，Ψ）來(lái)替換RNA序列的尿苷堿基6。這種修飾模擬內(nèi)源性mRNA，成功減少了mRNA與機(jī)體的TLR7/8和其他免疫傳感器的結(jié)合，限制I型IFN的過度產(chǎn)生并提高mRNA的翻譯能力6。除了Ψ，常用的mRNA修飾還有N1-甲基偽尿苷（N1-methylpseudouridine，m1ψ）。研究發(fā)現(xiàn)與ψ修飾相比，引入m1ψ的mRNA序列在增強(qiáng)蛋白表達(dá)的能力和逃脫機(jī)體天然免疫應(yīng)答的表現(xiàn)更好，尤其是在減少TLR3激活反應(yīng)方面7。此外，為了進(jìn)一步避免不必要的先天免疫激活，從IVT mRNA中去除dsRNA雜質(zhì)是非常重要。IVT mRNA的純化方法可以通過基于微珠的沉淀和色譜方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如高效液相色譜（HPLC）4。

Formulating mRNA with LNPs

經(jīng)修飾的mRNA轉(zhuǎn)錄物可以依靠LNP載體來(lái)保護(hù)其免于被細(xì)胞外的RNA酶（RNAse）降解，協(xié)助其順利進(jìn)入細(xì)胞和內(nèi)體逃逸3。不過，載體分子也可以與疫苗的免疫原性相關(guān)。LNP通常由不同比例的磷脂、膽固醇、可電離/陽(yáng)離子脂質(zhì)和PEG-脂質(zhì)組成4。盡管磷脂和膽固醇作為天然的細(xì)胞膜成分不太可能觸發(fā)顯著的先天免疫應(yīng)答，但一些可電離/陽(yáng)離子脂質(zhì)可以通過激活PRR通路誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)8。例如，Lonez et al.發(fā)現(xiàn)diC14-amidine脂質(zhì)體可刺激TLR49；另一種陽(yáng)離子脂質(zhì)RPR206252也被發(fā)現(xiàn)可以通過TLR2和NLRP3通路激活炎癥反應(yīng)10。此外，其他成分如PEG被指出可以激活補(bǔ)體系統(tǒng)，觸發(fā)機(jī)體的超敏反應(yīng)。LNP遞送系統(tǒng)的設(shè)計(jì)依然需要持續(xù)優(yōu)化，充分評(píng)估不同組件成分的炎癥性質(zhì)，以調(diào)節(jié)與體內(nèi)的先天免疫系統(tǒng)的相互作用。

Fig. 1: IVT mRNA and dsRNA byproducts-induced immune activation

Innate immune activation assessment

先天免疫感應(yīng)機(jī)制對(duì)mRNA疫苗可能是一把“shuang刃劍"。如上文所述，它可能抑制蛋白表達(dá)或?qū)е逻^度的炎癥反應(yīng)；不過，預(yù)防性疫苗或某些類型的癌癥疫苗可能會(huì)受益于其佐劑效應(yīng)12。例如有研究顯示輝瑞/BioNTech的新冠mRNA疫苗BNT162b2在小鼠體內(nèi)通過MDA-5信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生S蛋白特異性的CD8+ T細(xì)胞13，這種免疫反應(yīng)可能有助提高疫苗效力的持久性。重要的是，mRNA疫苗的成分除了需要精心設(shè)計(jì)，也需要一個(gè)靈敏而強(qiáng)大的平臺(tái)來(lái)評(píng)估它們的免疫原性，以確定mRNA疫苗的初步安全性和有效性。InvivoGen提供了一系列的PRR報(bào)告細(xì)胞，可以幫助測(cè)試納米材料和mRNA制劑的免疫刺激特性，例如我們的HEK293衍生的TLR3和TLR7報(bào)告基因細(xì)胞被Coolen et al.用來(lái)比較兩種不同納米顆粒材料的mRNA疫苗的免疫激活14；Son et al.采用了InvivoGen的HEK293衍生的TLR4和TLR7報(bào)告基因細(xì)胞系來(lái)檢測(cè)不同mRNA納米載體在TLR信號(hào)通路的參與15（產(chǎn)品信息請(qǐng)參見下文）。

References

1.U.S. Food and Drug Administration, 2022. Regulatory information, FDA-2020-D-1137. 2.Wolff, J.A. et al. 1990. Science 1990, 247, 1465–1468. 3.Rosa, S.S. et al. 2021. Vaccine, 39(16), 2190-2200. 4.Hou, X. et al. 2021. Nat Rev Mater 6, 1078–1094 (2021). 5.Vlatkovic, I. et al. 2021. Biomedicines, 9(5), 530. 6.Karikó, K. et al. 2008. Molecular therapy, 16(11), 1833-1840. 7.Andries, O. et al. 2015. Journal of Controlled Release, 217, 337-344. 8.Igyártó, B.Z. et al. 2021. Current opinion in virology, 48, 65-72. 9.Lonez, C. et al. 2015. Cell Mol. Life Sci. 2015, 72, 3971–3982. 10.Lonez, C. et al. 2014. Nanomedicine 2014, 10, 775–782. 11.Kozma, G.T. et al. 2019. ACS Nano 2019, 13, 9315–9324. 12.Pardl, N. et al. 2018. Nature reviews Drug discovery, 17(4), 261-279. 13.Li, C. et al. 2022. Nature Immunology, 23(4), 543-555. 14.Coolen, A.L. et al. 2019. Biomaterials, 195, 23-37. 15.Son, S. et al. 2020. Nano letters, 20(3), 1499-1509.

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Fig 2: TLR Response Profile. HEK-Blue™ reporter cells were stimulated with 1/10 dilution of the sample solution provided and a fixed concentration of positive controls. After 24h incubation, TLR-induced NF-κB activation was assessed by measuring the SEAP levels in cell supernatants using QUANTI-Blue™.

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